獲得功能性治愈的肝內(nèi)HBsAg陽(yáng)性患者中
整合HBV DNA及
cccDNA仍然保留轉(zhuǎn)錄活性
2019年，全球慢性乙型肝炎(CHB)患者約有2.96億人，并導(dǎo)致約82萬(wàn)人死亡，而中國(guó)有近8600萬(wàn)名慢性乙型肝炎患者。目前，慢乙肝患者經(jīng)過(guò)規(guī)范的抗病毒治療達(dá)到病毒學(xué)抑制后，仍有超過(guò)20%的患者可能會(huì)出現(xiàn)乙型肝炎病毒復(fù)發(fā)，然而復(fù)發(fā)的機(jī)制尚不完全清楚。有學(xué)者研究認(rèn)為病毒學(xué)復(fù)發(fā)與高水平的肝內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)DNA (cccDNA)相關(guān)，但消除肝內(nèi)cccDNA和HBV整合被認(rèn)為是一個(gè)概念性的終點(diǎn)，很難實(shí)現(xiàn)。
目前的治療方法更有可能實(shí)現(xiàn)cccDNA的轉(zhuǎn)錄沉默和HBV的整合。到目前為止，還沒(méi)有研究報(bào)道肝內(nèi)HBV的轉(zhuǎn)錄是否在通過(guò)聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)治療獲得功能性治愈的患者中完全沉默。有研究表明：PEG-IFN誘導(dǎo)的血清HBsAg已清除的患者中，肝內(nèi)HBsAg仍然呈陽(yáng)性，提示在這些患者中肝內(nèi)HBV RNA仍在轉(zhuǎn)錄，但尚不清楚它是來(lái)自cccDNA還是整合HBV DNA。綜上所述，進(jìn)一步探索cccDNA的微量轉(zhuǎn)錄行為和功能性HBV整合將有助于確定接受干擾素治療的功能性治愈患者肝內(nèi)殘留HBsAg的來(lái)源。
為了攻克上述難題，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了HBV捕獲測(cè)序、深度RNA測(cè)序和肝組織中肝內(nèi)HBV標(biāo)記物檢測(cè) （HBV RNA定量檢測(cè)與HBV cccDNA定量檢測(cè)），以全面研究PEG-IFN治療后功能性治愈患者整合HBV DNA和cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性。
中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院研究團(tuán)隊(duì)在2013年至2021年間，入組47名已經(jīng)獲得功能性治愈的患者、21名未獲得功能性治愈的患者及14名HBeAg陰性的初治患者。功能性治愈的標(biāo)準(zhǔn)為：血清HBsAg<0.05 IU/mL，血清HBV DNA水平<20 IU/mL，血清HBV前基因組RNA (pgRNA)低于檢測(cè)下限。
1.1 四分之一的功能性治愈患者肝內(nèi)仍存在HBsAg
功能性治愈患者肝內(nèi)cccDNA水平和HBsAg陽(yáng)性肝細(xì)胞比例顯著低于未治愈和初治HBeAg陰性患者（下圖A，圖B）。此外，25.5%的功能性治愈患者中存在HBsAg陽(yáng)性肝細(xì)胞，高達(dá)72.2%的功能性治愈患者在肝組織樣本中的可檢出HBV RNA 。表明基于PEG- IFN治療后的功能性治愈并不能導(dǎo)致肝內(nèi)HBsAg被完全清除，肝內(nèi)HBV RNA仍在轉(zhuǎn)錄。
（圖A.治愈組、非治愈組與初治組的cccDNA含量；圖B.治愈組、非治愈組與初治組的HBsAg陽(yáng)性肝細(xì)胞比例）
1.2 肝內(nèi)HBsAg陽(yáng)性的功能性治愈患者HBV RNA轉(zhuǎn)錄水平較高
相對(duì)于未治愈組，治愈組肝內(nèi)HBV RNA水平較低（下圖4B，p=0.004），而肝內(nèi)HBsAg陽(yáng)性的功能性治愈患者HBV RNA水平（下圖E，p=0.013）與總HBV RNA計(jì)數(shù)（下圖F，p=0.002）均高于肝內(nèi)HBsAg陰性的功能性治愈患者。
（圖B.獲得及未獲得功能性治愈患者肝內(nèi)HBV RNA含量；圖E.HBsAg陽(yáng)性及陰性患者肝內(nèi)HBV RNA含量; 圖F. HBsAg陽(yáng)性及陰性患者肝內(nèi)總HBV RNA計(jì)數(shù)）
1.3 肝內(nèi)HBsAg陽(yáng)性的功能性治愈患者的cccDNA和整合HBV仍具轉(zhuǎn)錄活性
經(jīng)RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)部分肝內(nèi)HBsAg陽(yáng)性的功能性治愈患者仍有微量的cccDNA轉(zhuǎn)錄，但肝內(nèi)HBV RNA主要來(lái)源于整合HBV DNA。
1.4 整合HBV和cccDNA具轉(zhuǎn)錄活性的功能性治愈患者存在病毒學(xué)復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)
4例存在微量的cccDNA轉(zhuǎn)錄活性的肝內(nèi)且HBsAg陽(yáng)性的功能性治愈患者中，有2例出現(xiàn)HBV復(fù)發(fā)（下圖A）。而另外有2名肝內(nèi)HBsAg陽(yáng)性但沒(méi)有cccDNA微量轉(zhuǎn)錄活性的功能性治愈患者，在至少108周的隨訪(fǎng)期間未發(fā)生HBV復(fù)發(fā)(下圖B)。因此，在基于PEG-IFN的治療后實(shí)現(xiàn)功能性治愈但肝內(nèi)HBsAg和cccDNA的仍有微量轉(zhuǎn)錄活性的患者可能有潛在的病毒學(xué)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。
（圖A. 存在HBV整合轉(zhuǎn)錄活性和cccDNA微量轉(zhuǎn)錄活性的功能性治愈患者的隨訪(fǎng)；圖B.僅有HBV整合轉(zhuǎn)錄活性的功能性治愈患者的隨訪(fǎng)）
本篇研究文章獲得國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、國(guó)家艾滋病和病毒性肝炎防治重大科技專(zhuān)項(xiàng)、廣州市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目等多項(xiàng)國(guó)家級(jí)與省級(jí)重大項(xiàng)目支持。
海力特生物利用其先進(jìn)的微量精準(zhǔn)核酸檢測(cè)技術(shù)，為中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院的高志良教授研究團(tuán)隊(duì)提供了高靈敏度的 HBV RNA定量檢測(cè)以及HBV cccDNA定量檢測(cè)技術(shù)支持。HBV RNA作為能夠反應(yīng)HBV cccDNA儲(chǔ)存庫(kù)活性的新型無(wú)創(chuàng)性標(biāo)志物，該標(biāo)志物的檢測(cè)目前已被2022年最新的慢性乙肝防治指南推薦應(yīng)用。
而高靈敏度HBV RNA定量檢測(cè)也能夠更好地進(jìn)行療效評(píng)估及監(jiān)測(cè)病毒庫(kù)的轉(zhuǎn)錄活性情況。在科研和臨床上也能夠更好地篩選出具良好預(yù)后的患者，為慢性乙型肝炎患者實(shí)現(xiàn)功能性治愈創(chuàng)造更多可能性。
文獻(xiàn)引用：
廣州海力特生物科技有限公司成立于2010年，是聚焦于重大傳染病的新一代核酸定量檢測(cè)產(chǎn)品和技術(shù)的領(lǐng)軍者。
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